Hall Pyhän Roodin palatsissa. Hän sanoo, että kaupungissa on mellakoita. Joku tuntematon hänelle väkijoukon edessä - äidit, naamioidut, soittajat soittokelloilla, ihmiset mustissa kupuissa - uhkasivat, ennustivat ja kehottivat ihmisiä olemaan tottelematta kuningattarta. Kuningatar Riccion käräjä vahvistaa, että hän myös tarkkailee ajoittain, kun ihmiset kuuntelevat innokkaasti näitä saartoja. Sivulla kerrotaan lisäksi, että ihmiset purskahtivat kuningattaren kappeliin huutaen: ”Papistien pesä!”, Että kuningattaren aviomiehen Darnleyn lempipuoli hyppäsi alttarille ja alkoi teeskennellä saarnaa, ja ihmiset vastasivat häntä pilkkaavilla kupilla. Queen Mary Stuart epätoivossa. Hän tuntee ihmisten vihan; suurin osa kohtelijoista on jättänyt hänet; hän ihmettelee, kuinka hänen kristinuskonsa voi olla niin erilainen kuin Skotlannin kansalaisten kristinusko. Riccio ehdottaa, että mietinnöistä vastuussa olevat henkilöt rangaistaan heti. Maria sanoo sivunsa, sivu selventää, kirjoitetaanko kuningattaren aviomiehen Heinrich Darnleyn nimi. Mary epäröi; hän epäilee, että mellakat olivat hänen inspiroituneita - väkijoukkoja johti kuninkaan takapuoli. Tässä Riccio muistuttaa häntä olevansa kuningatar; hän on kuin aurinko, ja hänellä on oikeus rangaista Jumalalta. Hän vaatii soittamaan välittömästi päivystyshenkilölle ilmoittamaan kuningattaren päätöksen. Douglas tulee sisään. Maria käskee häntä viemään paperin kuningaskansleri Mortonille, jotta hän leimaisi. Douglas skannaa asetuksen ja huomaa, että sillä ei ole kuninkaan nimeä. Hän kysyy kuningattarelta tästä. Riccio vastaa hänestä. Douglas on menettämässä malttiaan. Hän kehottaa kuningattarta olemaan käyttämättä veristä sortoa. Hän vihjaa näkevänsä sen ranskalaisen tai italian vaikutuksena. Mutta kuningatar muistuttaa kylmästä hänen voimastaan poistaa hänen tahtoaan tottelemattomat kohteet. Riccion ja Douglasin välillä puhkeaa riita. Douglas haastaa Riccion kaksintaisteluun ja vannoo tappavansa huomenna venetsialaisen. Kuningatar lähtee ja vie Riccion pois. Douglas jätetään yksin, hän harkitsee kaksintaistelua. Morton saapuu. Douglas näyttää hänelle päätöksen. Morton on päättämätön: hän pelkää sekä kuninkaan että kuningattaren vihaa. Ilman leimaamista, Morton tarjoaa kuninkaalle tarjouksen. Tällä hetkellä Henry oli keskusteluissa jesterinsä Nickin kanssa, joka kiusaa häntä siitä, että kuningattarella on todellinen valta Skotlannissa, ja Henry on vain hänen aviomiehensä, että kuningatar valitsee läheisiä, esimerkiksi tämän italialaisen harfisti Riccion ... Tällä hetkellä Morton tuo onneton päätöksen. Kuningas vihassaan, hän päättää tappaa Riccion. Kuningas Lindsay saapuu tuomioistuimeen, hän kutsuu kuninkaan metsästämään juuri hankitun hakon kanssa. Morton vastaa, että kuninkaalla on jo ammatti tänään. Lindsay liittyy mielellään tonttiin Riccioa vastaan. Hän kirjaimellisesti kieltää Riccion tappamisen tänä iltana, koska hänen täytyy tappaa hänet huomenaamuna. Sitten Henry, hyödyntäen viivettä, lähettää jesterin astrologille selvittääkseen, mikä tähdet sijaitsevat hänen aikomuksissaan.
Astrologi laboratoriossaan (hän on myös alkemisti) väittää itsensä kanssa, että kokemus vahvistaa tieteen turhaa, että tarkoitus, tähten tahto hallitsee ihmistä, hävittää hyvää ja pahaa. Nick tulee sisään, sprinkted witticism, astrologi ei ole ala-arvoinen hänelle. Nick kertoi, että kuningas lähetti hänet kysymään Riccion kohtalosta ja kehottaa astrologia ennustamaan Riccion kuoleman. Astrologi vastaa, että tähdet kertovat hänelle, ei ihmisille, ja ennustaa puolestaan jesterin kuoleman. Sen kanssa hän lähtee. Astrologin aiheuttama kuningattaren sivu tulee näkyviin. Page rakastaa rakastajatariaan. Astrologi käskee hänen kertoa kuningattarelle, että tänään mies, jota hän rakastaa, kuolee. "Kuinka Botwell kuolee tänään?" - huudahtaa sivu. Astrologi on hämmentynyt. Hänellä oli mielessä Riccio ja kiirehtii sivua varoittamaan häntä tästä. Yksin jättäen, astrologi ihmettelee - tähtiistä ilmeni myös, että Botwell oli jotenkin pimeässä yhteydessä kuningattareen - Marsin, Saturnuksen kautta ... Botwell saapuu. Hänen monologistaan käy selväksi, että hän löysi odottamatta astrologin talosta. Saatuaan tietää missä Botwell kysyi astrologilta, kuinka paljon hänellä on jäljellä elää. Vanha mies vastaa, että kolme vuotta ja että Botwell on kuningas. Botwell ottaa pois pullon myrkkyä, jonka kanssa hän halusi itsemurhan, haluaa heittää sen pois - ja epäröi. Tosiaankin, palatsien juonittelujen ilmapiirissä kaikki aseet ovat hyödyllisiä. Hän lähtee.
Sivu kertoo kuningattarelle, että Riccio tulee pian. Kuningatar odottaa häntä - hänen mielestään hän yksin pysyi uskollisena hänelle. "Ja Botvel?" Sivu kysyy. "Kuka on Botvel?" - kuningatar on kiinnostunut. Yllättynyt sivu kertoo Marialle, kuinka veneilyn aikana voimakas tuuli repäisi ruusun kuningatar päästä, kukka putosi veteen. Ja sitten yksi miehistöistä - Botvel - ryntäsi veneeseen ja ajoi peloissaan souttajaa saadakseen ruusun vedestä. Kuultuaan tarinan, Mary lähettää sivun rukoilemaan. Hän tunnustaa jumalalle, ettei hänellä ole enää voimaa vastustaa hänen rakkauttaan Botwelliin. Kuningatar tietää, että tuomioistuimessa hänet pidetään rakastuneena Riccioon. Riccio tulee sisään. Mary ilmoittaa häntä uhkaavan kuolevaisuusvaaran ja jättää kylmästi hyvästit hänelle osoittaen hänelle laivaan, joka vie hänet Roomaan. Epätoivoisesti Riccio yrittää pyytää kuningattarta peruuttamaan poistumispäätöksensä. Kuningatar on pysyvä.
Heinrich, Morton ja Lindsay saivat tietää Riccion lähestymisestä ja sitoutuivat kiireellisesti tappamaan hänet tai antamaan hänelle purjehtia. Sitten Douglas ilmestyy ja ilmoittaa, että Riccio on jo purjehtinut. Douglas epätoivossaan, hän kaipaa veristä kostoa, ritarin kunnia loukkaantuu. Yhtäkkiä he kohtaavat sivun, joka tuo kuningattarelle huomautuksen Riccio - hän ei lähtenyt ja on hänen kanssaan illalla. Salaliitot vievät nuotin.
Maria on kiireinen brodeeraus huoneessaan. Tuleva Riccio selittää hänelle, että hän ei voinut poistua, koska hänellä on aamuna kaksintaistelu Douglasin kanssa. Hän myöntää, että hän ei tarvitse elämää ilman hänen rakkauttaan. Hän pyytää Marya antamaan hänelle ruusun seppeleen - hän istuttaa kukat alttarille Roomassa ... Henry, Douglas ja Dindsay tulevat ja tappavat Riccion. Kuningatar heikottaa. Douglas lyö häpeää ja kauhua - hän jää vapaaehtoisesti eläkkeelle maanpakoon. Henry on huolissaan siitä, että kuningatar vihaa häntä. Lindsay vie kuninkaan pois, kuiskaten hänelle tulevasta metsästyksestä. Queen kutsuu kuningatar Botwellin. Mary tulee järkiinsä, näkee Botvelin ja tunnustaa rakkautensa hänelle. Botwell pakottaa hänet myöntämään, että hän haluaa Henryn kuoleman, ja antaa hänelle myrkypullon sanomalla, että tämä on unilääke. Mary antaa kuninkaalle tämän "lääkkeen", mutta myrkyt juovat puhvelin. Mikään ei kuitenkaan voi pysäyttää murhaista juonittelua - Botwell räjäyttää kuningas Henryn talon. Etäisyydessä kuuluu väkijoukon kasvavia itkuja. Botvel kuningatar kanssa piilossa.